PCR, ana DNT-ni şablon kimi və spesifik primerləri uzatmanın başlanğıc nöqtəsi kimi istifadə edərək, DNT polimerazın katalizi altında sistemə dNTP, Mg2+, uzanma faktorları və gücləndirici amillərin əlavə edilməsinə istinad edən polimeraza zəncirvari reaksiyadır. Denatürasiya, yumşalma, uzatma və s. addımlar vasitəsilə ana zəncir şablonu DNT-ni tamamlayan qız zəncirinin DNT-nin in vitro replikasiyası prosesi istənilən hədəf DNT-ni in vitroda tez və xüsusi şəkildə gücləndirə bilər.
1. İsti başlanğıc PCR
Adi PCR-də gücləndirmənin başlama vaxtı PCR aparatını PCR maşınına qoymaq deyil, sonra proqram gücləndirməyə başlayır.Sistem konfiqurasiyası tamamlandıqdan sonra gücləndirmə başlayır ki, bu da qeyri-spesifik gücləndirməyə səbəb ola bilər və isti başlanğıc PCR bu problemi həll edə bilər.
İsti başlanğıc PCR nədir?Reaksiya sistemi hazırlandıqdan sonra ferment modifikatoru reaksiyanın ilkin qızdırma mərhələsində və ya “isti başlanğıc” mərhələsində yüksək temperaturda (adətən 90°C-dən yüksək) buraxılır ki, DNT polimeraza aktivləşsin.Dəqiq aktivləşmə vaxtı və temperaturu DNT polimerazanın təbiətindən və isti başlanğıc modifikatorundan asılıdır.Bu üsul əsasən DNT polimerazanın fəaliyyətini maneə törətmək üçün antikorlar, yaxınlıq liqandları və ya kimyəvi modifikatorlar kimi modifikatorlardan istifadə edir.DNT polimerazanın aktivliyi otaq temperaturunda inhibə edildiyi üçün isti başlanğıc texnologiyası PCR reaksiyalarının spesifikliyini itirmədən otaq temperaturunda çoxsaylı PCR reaksiya sistemlərinin hazırlanması üçün böyük rahatlıq təmin edir.
2. RT-PCR
RT-PCR (Reverse Transscription PCR) mRNT-dən cDNA-ya tərs transkripsiya və onu gücləndirmə üçün şablon kimi istifadə etmək üçün eksperimental texnikadır.Eksperimental prosedur əvvəlcə toxumalarda və ya hüceyrələrdə ümumi RNT çıxarmaq, primer kimi Oliqodan (dT) istifadə etmək, cDNA sintez etmək üçün əks transkriptazadan istifadə etmək və sonra hədəf geni əldə etmək və ya gen ifadəsini aşkar etmək üçün PCR gücləndirilməsi üçün şablon kimi cDNA-dan istifadə etməkdir.
3. Floresan kəmiyyət PCR
Floresan kəmiyyət PCR (Real-time Quantitative PCR,RT-qPCR) real vaxt rejimində bütün PCR prosesini izləmək üçün flüoresan siqnalların yığılmasından istifadə edərək və nəhayət şablonu kəmiyyətcə təhlil etmək üçün standart əyridən istifadə edərək, PCR reaksiya sisteminə flüoresan qrupların əlavə edilməsi üsuluna aiddir.Ümumi istifadə edilən qPCR metodlarına SYBR Green I və TaqMan daxildir.
4. Daxili PCR
İç-içə PZR, iki raund PCR gücləndirilməsi üçün iki dəst PCR primerinin istifadəsinə aiddir və ikinci raundun gücləndirmə məhsulu hədəf gen fraqmentidir.
Birinci cüt primerlərin (xarici primerlərin) uyğunsuzluğu qeyri-spesifik məhsulun gücləndirilməsinə səbəb olarsa, eyni qeyri-spesifik bölgənin ikinci primer cütü tərəfindən tanınması və gücləndirilməsinin davam etməsi ehtimalı çox kiçikdir, ona görə də primerlərin ikinci cütü ilə gücləndirmə , PCR spesifikliyi yaxşılaşdırıldı.İki tur PCR yerinə yetirməyin bir üstünlüyü odur ki, məhdud başlanğıc DNT-dən kifayət qədər məhsulu gücləndirməyə kömək edir.
5. Touchdown PCR
Touchdown PCR, PCR dövrünün parametrlərini tənzimləməklə PCR reaksiyasının spesifikliyini yaxşılaşdırmaq üçün bir üsuldur.
Toxunma PCR-də ilk bir neçə dövr üçün yumşalma temperaturu primerlərin maksimum yumşalma temperaturundan (Tm) bir neçə dərəcə yuxarı təyin edilir.Daha yüksək tavlama temperaturu qeyri-spesifik gücləndirməni effektiv şəkildə azalda bilər, lakin eyni zamanda, daha yüksək yumşalma temperaturu primerlərin və hədəf ardıcıllıqların ayrılmasını ağırlaşdıracaq, nəticədə PCR məhsuldarlığı azalacaq.Buna görə də, ilk bir neçə dövrədə, sistemdəki hədəf genin məzmununu artırmaq üçün yumşalma temperaturu adətən dövr başına 1°C azalmağa təyin edilir.Yuvlama temperaturu optimal temperatura endirildikdə, yumşalma temperaturu qalan dövrlər üçün saxlanılır.
6. Birbaşa PCR
Birbaşa PCR, nuklein turşusunun təcridinə və təmizlənməsinə ehtiyac olmadan birbaşa nümunədən hədəf DNT-nin gücləndirilməsinə aiddir.
İki növ birbaşa PCR var:
birbaşa üsul: az miqdarda nümunə götürün və onu PCR identifikasiyası üçün birbaşa PCR Master Mixə əlavə edin;
krekinq üsulu: nümunə götürdükdən sonra onu lizata əlavə edin, genomu buraxmaq üçün lizizə edin, az miqdarda lizizə olunmuş supernatant götürün və onu PCR Master Mixə əlavə edin, PCR identifikasiyasını həyata keçirin.Bu yanaşma eksperimental iş prosesini asanlaşdırır, praktiki iş vaxtını azaldır və təmizlənmə mərhələləri zamanı DNT itkisinin qarşısını alır.
7. SOE PCR
Üst-üstə düşmə uzadılması ilə gen birləşməsi PCR (SOE PCR) PCR məhsullarını üst-üstə düşən zəncirlər yaratmaq üçün tamamlayıcı ucları olan primerlərdən istifadə edir, beləliklə, sonrakı gücləndirmə reaksiyasında üst-üstə düşən zəncirlərin uzadılması vasitəsilə gücləndirilmiş fraqmentlərin üst-üstə düşdüyü A texnikasının müxtəlif mənbələri və bir-birinə yapışdırılır.Bu texnologiya hazırda iki əsas tətbiq istiqamətinə malikdir: füzyon genlərinin qurulması;gen sahəsinə yönəlmiş mutasiya.
8. IPCR
Tərs PCR (IPCR) iki primerdən başqa DNT fraqmentlərini gücləndirmək üçün əks tamamlayıcı primerlərdən istifadə edir və məlum DNT fraqmentinin hər iki tərəfində naməlum ardıcıllığı gücləndirir.
IPCR əvvəlcə bitişik naməlum bölgələrin ardıcıllığını müəyyən etmək üçün nəzərdə tutulmuşdur və daha çox gen promotor ardıcıllığını öyrənmək üçün istifadə olunur;gen füzyonu, translokasiya və transpozisiya kimi onkogen xromosomların yenidən qurulması;və viral gen inteqrasiyası, indi də tez-tez istifadə olunur. Sahəyə yönəldilmiş mutagenez üçün, istədiyiniz mutasiya ilə plazmidi kopyalayın.
9. dPCR
Rəqəmsal PCR (dPCR) nuklein turşusu molekullarının mütləq kəmiyyətini təyin etmək üçün bir üsuldur.
Hal-hazırda nuklein turşusu molekullarının miqdarını təyin etmək üçün üç üsul mövcuddur.Fotometriya nuklein turşusu molekullarının udulmasına əsaslanır;real vaxtda flüoresan kəmiyyət PCR (Real Time PCR) Ct dəyərinə əsaslanır və Ct dəyəri aşkar edilə bilən flüoresan dəyərinə uyğun dövr nömrəsinə aiddir;rəqəmsal PCR nuklein turşusunun hesablanması üçün tək molekullu PCR metoduna əsaslanan ən son Kəmiyyət texnologiyasıdır.
Göndərmə vaxtı: 13 iyun 2023-cü il